試驗設計

       試驗材料：干酪乳桿菌LZ183E、海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉和谷氨酸鈉。

       凍干菌劑的制備：將保存的LZ183E菌液在MＲS液體培養基中37℃過(guò)夜活化3代，把活化后處于對數生長(cháng)期的LZ183E以2%（體積分數）的接種量接種于優(yōu)化后的MＲS培養基中，37℃高密度培養30 h，獲得菌液備用；在無(wú)菌的條件下，取2 mL菌液于10 mL無(wú)菌離心管中，8000 r/min、4℃離心3 min，然后用滅菌生理鹽水進(jìn)行2次清洗，得到菌泥，再向含菌泥的10 mL離心管中加入2 mL已配制的凍干保護液，于－80℃冰箱中凍存6 h，然后迅速放入真空冷凍干燥機中干燥24 h以上，直至菌液凍干呈顯棉絮狀，得到凍干菌劑，此過(guò)程保持無(wú)菌。

       單一組分的凍干保護劑用量的確定：通過(guò)單因素試驗考察海藻糖、脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉等保護劑的用量對LZ183E在冷凍過(guò)程中存活率的影響；制備凍干菌劑時(shí)，控制真空冷凍干燥機條件不變，以菌株存活率和菌劑產(chǎn)酸能力為指標，探究不同質(zhì)量分數的海藻糖（2%、4%、6%、8%、10%）、低聚木糖（2%、4%、6%、8%和10%）、脫脂乳粉（2%、6%、10%、14%和18%）、谷氨酸鈉（0.5%、1.0%、1.5%、2．0%和2.5%）對菌株LZ183E在凍干以后活力的影響，確定其適宜的濃度范圍，并以未加保護劑為空白對照組（CK組）。

復配保護劑的響應面法優(yōu)化：在單因素試驗的基礎上，以菌株存活率為指標，選取對菌株活性影響顯著(zhù)的3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的響應面試驗進(jìn)行復配優(yōu)化，確定保護劑的最佳配比。

       測定方法：測定LZ183E在冷凍過(guò)程中的活菌數，再將凍干菌粉按原比例復溶進(jìn)行試驗，計算凍干前后菌株存活率；將凍干后的菌劑以3%的接種量加入滅菌后的脫脂牛奶中，37℃發(fā)酵12 h后測定發(fā)酵乳的pH值。

試驗結果

（1）海藻糖用量對菌劑活力的影響

       由圖1可知，海藻糖用量在2%～10%（質(zhì)量分數）時(shí)對LZ183E在凍干過(guò)程的保護作用無(wú)顯著(zhù)差異（P＞0.05），菌株存活率處于波動(dòng)狀態(tài)，但凍干后菌株LZ183E仍然維持較高活力，其存活率在（93.479±1.667）%～（97.326±0.25）%，顯著(zhù)高于CK組（P＜0.05）。當海藻糖用量在6%（質(zhì)量分數）時(shí)，對菌株的保護效果最好，并且此時(shí)菌劑的產(chǎn)酸能力也對應較強，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳的pH相對較低，為4.572±0.002，因此當海藻糖添加量為6%（質(zhì)量分數）時(shí)對菌株的保護作用較好。

（2）低聚木糖用量對菌劑活力的影響

       由圖2可知，隨著(zhù)低聚木糖用量的增加，LZ183E在凍干后的存活率表現出先上升后下降的趨勢，在10%（質(zhì)量分數）的添加量時(shí)具有最高存活率（96.081±0.395）%，明顯高于CK組；尤其當用量從2%升至6%（質(zhì)量分數）時(shí)，菌株存活率顯著(zhù)升高（P＜0.05），而此后隨著(zhù)用量進(jìn)一步增大，其存活率的增加或降低并不顯著(zhù)（P＞0.05），表明低聚木糖在低濃度時(shí)其保護效果具有濃度差異性，而當過(guò)高時(shí)已經(jīng)飽和對菌株的保護效果不明顯；此外，菌劑在產(chǎn)酸能力上，隨著(zhù)低聚木糖用量的升高也表現出較強的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳pH可降低至4.5以下，這進(jìn)一步表明低聚木糖可作為益生因子而促進(jìn)LAB的生長(cháng)代謝，因此，當低聚木糖添加量為10%（質(zhì)量分數）時(shí)對菌株的保護作用較好。

（3）脫脂乳粉用量對菌劑活力的影響

       由圖3可知，脫脂乳粉的保護作用存在用量依賴(lài)性，隨脫脂乳粉用量的增加，LZ183E的存活率緩慢上升，在10%～14%（質(zhì)量分數）趨于穩定，此時(shí)菌株存活率高于97%，而當高于14%的用量時(shí)存活率急劇下降（P＜0.05），但仍然高于CK組；且菌劑的產(chǎn)酸能力也表現出對應關(guān)系，菌株存活率越高，產(chǎn)酸能力越強，因此，當脫脂乳粉添加量為10%（質(zhì)量分數）時(shí)對菌株的保護作用較好。

（4）谷氨酸鈉用量對菌劑活力的影響

       由圖4可知，谷氨酸鈉用量在0.5%～1.5%（質(zhì)量分數）時(shí)菌株保持著(zhù)高于95%的存活率，當用量大于1.5%（質(zhì)量分數）時(shí)干菌株存活率顯著(zhù)下降（P＜0.05），并且用量在2．5%（質(zhì)量分數）時(shí)存活率最低，為（85.758±0.949）%，已經(jīng)接近CK組，對菌株的保護作用表現出明顯不足。此時(shí)產(chǎn)酸能力也相對較弱，但對整體產(chǎn)酸能力影響不大，因此，當谷氨酸鈉添加量為1.5%（質(zhì)量分數）時(shí)對菌株的保護作用較好。

（5）復配保護劑的響應面分析法優(yōu)化結果

       通過(guò)分析單因素試驗結果，控制海藻糖用量為6%，以L(fǎng)．casei LZ183E存活率為指標，進(jìn)一步對低聚木糖、脫脂乳粉以及谷氨酸鈉復配用量進(jìn)行優(yōu)化，其Box-Behnken設計表及結果分別見(jiàn)表1和表2。

軟件Design Expert V 10對試驗結果擬合的回歸方程為Y=98.2268+0.55125X₁－0.320125X₂－0.350875X₃－1.063X₁X₂－0.1345X₁X₃－0.05775X₂X₃－1.346275X₁²－1.087025X₂²－0.207525X₃²，其方差分析結果如表3所示。

由表3可知，本實(shí)驗建立的模型極顯著(zhù)（P＜0.01），失擬項不顯著(zhù)（P＞0.05），因此模型可靠性較高；并且Ｒ²=0.9125，說(shuō)明脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉對LZ183E存活率的影響顯著(zhù)；信噪比（signal-to-noise，S/N）=8.7284＞4，也從另一角度說(shuō)明所建立的模型是可靠的；經(jīng)方差分析，3個(gè)因素對凝固型發(fā)酵牛乳影響的主次順序為X₁＞X₃＞X₂，即脫脂乳粉用量＞谷氨酸鈉用量＞低聚木糖用量；研究表明，響應面的等高線(xiàn)越偏向橢圓，因素間交互作用越強；并且其呈現在閉合的橢圓或圓形，表明在試驗范圍內有最值。

由圖5可知，當谷氨酸鈉用量保持不變時(shí)，隨著(zhù)脫脂乳粉和低聚木糖用量的升高，菌株存活率均表現為先升后降，脫脂乳粉用量在8.5%～13.5%（質(zhì)量分數）和低聚木糖量在6%～10.5%（質(zhì)量分數）較為適宜；等高線(xiàn)呈現閉合橢圓且響應面為凸形，表明脫脂乳粉用量和低聚木糖用量交互作用顯著(zhù)，并且此區間內有最大值；當低聚木糖用量不變時(shí)，隨著(zhù)脫脂乳粉和谷氨酸鈉用量的增大，菌株存活率也表現出先增后降的趨勢，脫脂乳粉用量在8.7%～13.2%（質(zhì)量分數）和谷氨酸鈉用量在0.3%～1.75%（質(zhì)量分數）較佳；此范圍內等高線(xiàn)為閉合橢圓且響應面為凸形，說(shuō)明脫脂乳粉用量和谷氨酸鈉用量交互作用有最大值；當脫脂乳粉用量不變時(shí)，隨低聚木糖和谷氨酸鈉用量的增加，菌株存活率同樣表現為先增后降的趨勢，低聚木糖用量在7.1%～11.9%（質(zhì)量分數），谷氨酸鈉用量在0.4%～18%（質(zhì)量分數）較佳；此時(shí)等高線(xiàn)的形狀為閉合橢圓且響應面為凸形，說(shuō)明在此區間內低聚木糖和谷氨酸鈉交互作用強，并具有最大值；上述分析和表3中的顯著(zhù)性一致。

試驗結論

在高密度培養的基礎上，以干酪乳桿菌LZ183E為研究對象，菌株存活率和菌劑產(chǎn)酸能力為響應指標，通過(guò)單因素試驗考察4種保護劑（海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉和谷氨酸鈉）用量對菌株活力的影響，在此基礎上采用響應面法對保護劑進(jìn)行復配優(yōu)化，并對最優(yōu)條件下的菌劑的活力和產(chǎn)酸能力作出評價(jià)；結果表明，海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉以及谷氨酸鈉對干酪乳桿菌LZ183E在凍干過(guò)程中有明顯的保護效果，并且其最佳復配參數為海藻糖用量6.0%、低聚木糖用量8.5%、脫脂乳粉用量11.5%和谷氨酸鈉用量1.0%（均為質(zhì)量分數），此條件下菌株存活率為（98.236±0.137）%，顯著(zhù)高于未加保護劑的菌劑的存活率（79.241±0.382）%；在此最優(yōu)配比下進(jìn)行驗證試驗，菌株的存活率為（98.236±0.137）%，接近模型的預測值，證明此模型是可靠的。

參考資料：

周佳豪,雷文平,劉成國,周輝,周杏榮,葉望娟.高活菌數干酪乳桿菌LZ183E凍干保護劑的制備[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46(24):138-143.