試驗設計

 試驗設計：以C57BL/6為背景的野生型（WT）和Il10-/-小鼠（8周齡）作為研究對象，將雄性野生型（WT）小鼠被分配到WT組，Il10-/-小鼠被分別分配到白細胞介素-10基因缺陷（IL-KO）組和XOS組，每組有6-8只8周齡的小鼠，XOS組的小鼠接受1.0g/kg/天的95% XOS（由河南益常青生物科技有限公司提供）灌胃，持續4周后，將小鼠安樂(lè )死，收集其組織。

 結腸炎的評估：XOS干預期間，每周測量小鼠體重和疾病活動(dòng)指數（DAI）的變化；收集結腸組織，用尺子測量；對用蘇木精和伊紅（H&E）染色的結腸標本進(jìn)行組織學(xué)評分，每只小鼠0-4分，所有評分納入相應組的統計。

 生化指標測定：測定結腸組織中的髓過(guò)氧化物酶活性、血清細胞因子IL-6、C-反應蛋白（CRP）和紅細胞沉降率（ESR）；測量TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-17A的結腸信使RNA水平。

 評價(jià)粘液細菌的滲透：基于每個(gè)樣品的整個(gè)腸道橫截面的觀(guān)察，使用熒光原位雜交法對DNA染色的切片進(jìn)行盲評的，分數0-4；統計結腸隱窩中的細菌數量；測量結腸黏液的厚度。

 杯狀細胞的數量以及膜腔面積的測定：計算杯狀細胞的數量；測量小泡細胞的粘液填充面積。

 免疫印跡：將結腸組織均質(zhì)化，在4℃下以15000轉/分的速度離心15分鐘，使用ImageJ軟件進(jìn)行量化，結果與GAPDH歸一化，并以目標蛋白表達/GAPDH表達比率計算。

 肝臟和腎臟功能的測定：測定小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、肌酐和尿素氮。

試驗結果

（1）XOS干預改善了Il10-/-小鼠的自發(fā)性結腸炎

 如圖1A-C所示，WT組和IL-10-KO組的小鼠體重差異從第2周開(kāi)始升高，在第4周有顯著(zhù)差異；測量小鼠結腸組織發(fā)現IL-10-KO組小鼠結腸明顯縮短，4周的XOS干預改善了生長(cháng)緩慢和結腸縮短的情況；圖1D顯示，在DAI方面，Il10-/-小鼠的得分隨著(zhù)時(shí)間的推移逐漸增加，且與WT小鼠相比更高，表明有明顯的結腸炎；圖1E顯示，組織學(xué)上，Il10-/-小鼠出現了明顯的腸道炎癥，粘膜上有零星的免疫細胞堆積，腸腺結構受損；圖1F顯示，Il10-/-小鼠的炎癥評分明顯高于WT小鼠，XOS組的Il10-/-小鼠有明顯的輕度結腸炎癥，炎癥評分較低，并伴有少量的炎癥細胞浸潤和腺體結構損傷。

（2）XOS干預改善了中性粒細胞浸潤和細胞因子表達

 如圖2A所示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的MPO濃度更高，XOS干預后MPO濃度顯著(zhù)降低；圖2B-E顯示，與IL-10-KO組相比，XOS組小鼠的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-17A的表達水平更低；圖2F-H顯示， Il10-/小鼠血液中的IL-6、ESR和CRP水平在第8周至第12周顯著(zhù)增加，而在XOS干預組中增加不明顯。

（3）XOS干預改善了Il10-/-小鼠的粘液細菌滲透情況

 如圖3A所示，在WT小鼠中，細菌處于在內層粘液層之外，微生物群在內層粘液層和腔內糞便內容物之間形成一個(gè)線(xiàn)性結構夾層；Il10-/-小鼠的細菌與上皮細胞直接接觸，其中一些細菌位于隱窩深處，這表明細菌的滲透發(fā)生在腸結腸炎發(fā)生的早期，在XOS的干預下，細菌的滲透得到了明顯的改善；圖3B-D的結果顯示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的隱窩表面和底部有更多的細菌定植，而XOS干預可以減少細菌的定植。

（4）XOS干預調節了Il10-/-小鼠的粘液屏障

 如圖4A和圖4B所示，三組中所有小鼠的粘液層和杯狀細胞的厚度相似；圖4C結果顯示，在Il10-/-小鼠中，粘液填充的杯狀細胞膜面積減少；圖4D對WT小鼠組織的評估顯示，上皮細胞表面有明顯的粉紅色染色（中性碳水化合物）（可能是分泌的粘液蛋白），而杯狀細胞內有明顯的藍色染色（酸性碳水化合物），相反，Il10-/-小鼠的組織顯示出粘蛋白染色的顯著(zhù)變化，整個(gè)組織呈深藍色/紫色，表明中性和酸性粘蛋白的分布和表達模式發(fā)生了變化。以上說(shuō)明XOS的作用不僅影響了杯狀細胞的數量，而且還顯著(zhù)改善了粘液填充的杯狀細胞膜面積，且在XOS干預后，WT型小鼠Il10 - / -小鼠的PAS/AB染色變化得到改善。

（5）XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能

 如圖5所示，免疫印跡結果顯示，在Il10-/-小鼠中，LC3-II蛋白和LC3-II/I的表達都明顯減少，p62和beclin-1的表達增加。經(jīng)XOS處理后的Il10-/-小鼠恢復了上述變化，說(shuō)明XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能。

（6）XOS干預的安全性

 如圖6所示，小鼠每天口服灌胃1.0g/kg 95% XOS耐受性良好，沒(méi)有觀(guān)察到明顯的宏觀(guān)不良反應，每組的肝腎功能在基礎和干預后都沒(méi)有明顯的變化。

試驗結論

 本文通過(guò)研究XOS干預對Il10-/-小鼠（IBD模型）的影響，結果表明XOS干預的Il10-/-小鼠呈現出明顯的輕度自發(fā)性結腸炎，疾病活動(dòng)指數、組織學(xué)評分和腸道炎癥細胞因子水平較低；飲食中的XOS降低了在腸道結腸炎發(fā)病早期的腸道粘液的細菌滲透率；XOS的作用與結腸中LC3II/I的表達回復和p62及beclin-1的表達減少有關(guān)。因此XOS降低了結腸粘液微生物群的滲透，并恢復了自噬的功能，表明XOS可能是一種潛在的膳食補充劑或功能食品，可用于IBD的早期管理。

參考資料：

Chen Z, Shen X, Zhou Q; et al. Dietary xylo-oligosaccharide ameliorates colonic mucus microbiota penetration with restored autophagy in interleukin-10 gene-deficient mice.[J].JPEN. Journal of parenteral and enteral nutrition,2021,Vol.46(5): 1130-1140.