試驗設計 試驗設計:以C57BL/6為背景的野生型(WT)和Il10-/-小鼠(8周齡)作為研究對象,將雄性野生型(WT)小鼠被分配到WT組,Il10-/-小鼠被分別分配到白細胞介素-10基因缺陷(IL-KO)組和XOS組,每組有6-8只8周齡的小鼠,XOS組的小鼠接受1.0g/kg/天的95% XOS(由河南益常青生物科技有限公司提供)灌胃,持續4周后,將小鼠安樂(lè )死,收集其組織。 結腸炎的評估:XOS干預期間,每周測量小鼠體重和疾病活動(dòng)指數(DAI)的變化;收集結腸組織,用尺子測量;對用蘇木精和伊紅(H&E)染色的結腸標本進(jìn)行組織學(xué)評分,每只小鼠0-4分,所有評分納入相應組的統計。 生化指標測定:測定結腸組織中的髓過(guò)氧化物酶活性、血清細胞因子IL-6、C-反應蛋白(CRP)和紅細胞沉降率(ESR);測量TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-17A的結腸信使RNA水平。 評價(jià)粘液細菌的滲透:基于每個(gè)樣品的整個(gè)腸道橫截面的觀(guān)察,使用熒光原位雜交法對DNA染色的切片進(jìn)行盲評的,分數0-4;統計結腸隱窩中的細菌數量;測量結腸黏液的厚度。 杯狀細胞的數量以及膜腔面積的測定:計算杯狀細胞的數量;測量小泡細胞的粘液填充面積。 免疫印跡:將結腸組織均質(zhì)化,在4℃下以15000轉/分的速度離心15分鐘,使用ImageJ軟件進(jìn)行量化,結果與GAPDH歸一化,并以目標蛋白表達/GAPDH表達比率計算。 肝臟和腎臟功能的測定:測定小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、肌酐和尿素氮。 試驗結果 (1)XOS干預改善了Il10-/-小鼠的自發(fā)性結腸炎 如圖1A-C所示,WT組和IL-10-KO組的小鼠體重差異從第2周開(kāi)始升高,在第4周有顯著(zhù)差異;測量小鼠結腸組織發(fā)現IL-10-KO組小鼠結腸明顯縮短,4周的XOS干預改善了生長(cháng)緩慢和結腸縮短的情況;圖1D顯示,在DAI方面,Il10-/-小鼠的得分隨著(zhù)時(shí)間的推移逐漸增加,且與WT小鼠相比更高,表明有明顯的結腸炎;圖1E顯示,組織學(xué)上,Il10-/-小鼠出現了明顯的腸道炎癥,粘膜上有零星的免疫細胞堆積,腸腺結構受損;圖1F顯示,Il10-/-小鼠的炎癥評分明顯高于WT小鼠,XOS組的Il10-/-小鼠有明顯的輕度結腸炎癥,炎癥評分較低,并伴有少量的炎癥細胞浸潤和腺體結構損傷。
(2)XOS干預改善了中性粒細胞浸潤和細胞因子表達 如圖2A所示,與WT小鼠相比,Il10-/-小鼠的MPO濃度更高,XOS干預后MPO濃度顯著(zhù)降低;圖2B-E顯示,與IL-10-KO組相比,XOS組小鼠的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-17A的表達水平更低;圖2F-H顯示, Il10-/小鼠血液中的IL-6、ESR和CRP水平在第8周至第12周顯著(zhù)增加,而在XOS干預組中增加不明顯。
(3)XOS干預改善了Il10-/-小鼠的粘液細菌滲透情況 如圖3A所示,在WT小鼠中,細菌處于在內層粘液層之外,微生物群在內層粘液層和腔內糞便內容物之間形成一個(gè)線(xiàn)性結構夾層;Il10-/-小鼠的細菌與上皮細胞直接接觸,其中一些細菌位于隱窩深處,這表明細菌的滲透發(fā)生在腸結腸炎發(fā)生的早期,在XOS的干預下,細菌的滲透得到了明顯的改善;圖3B-D的結果顯示,與WT小鼠相比,Il10-/-小鼠的隱窩表面和底部有更多的細菌定植,而XOS干預可以減少細菌的定植。
(4)XOS干預調節了Il10-/-小鼠的粘液屏障 如圖4A和圖4B所示,三組中所有小鼠的粘液層和杯狀細胞的厚度相似;圖4C結果顯示,在Il10-/-小鼠中,粘液填充的杯狀細胞膜面積減少;圖4D對WT小鼠組織的評估顯示,上皮細胞表面有明顯的粉紅色染色(中性碳水化合物)(可能是分泌的粘液蛋白),而杯狀細胞內有明顯的藍色染色(酸性碳水化合物),相反,Il10-/-小鼠的組織顯示出粘蛋白染色的顯著(zhù)變化,整個(gè)組織呈深藍色/紫色,表明中性和酸性粘蛋白的分布和表達模式發(fā)生了變化。以上說(shuō)明XOS的作用不僅影響了杯狀細胞的數量,而且還顯著(zhù)改善了粘液填充的杯狀細胞膜面積,且在XOS干預后,WT型小鼠Il10 - / -小鼠的PAS/AB染色變化得到改善。
(5)XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能 如圖5所示,免疫印跡結果顯示,在Il10-/-小鼠中,LC3-II蛋白和LC3-II/I的表達都明顯減少,p62和beclin-1的表達增加。經(jīng)XOS處理后的Il10-/-小鼠恢復了上述變化,說(shuō)明XOS干預恢復了Il10-/-小鼠的自噬功能。
(6)XOS干預的安全性 如圖6所示,小鼠每天口服灌胃1.0g/kg 95% XOS耐受性良好,沒(méi)有觀(guān)察到明顯的宏觀(guān)不良反應,每組的肝腎功能在基礎和干預后都沒(méi)有明顯的變化。
試驗結論 本文通過(guò)研究XOS干預對Il10-/-小鼠(IBD模型)的影響,結果表明XOS干預的Il10-/-小鼠呈現出明顯的輕度自發(fā)性結腸炎,疾病活動(dòng)指數、組織學(xué)評分和腸道炎癥細胞因子水平較低;飲食中的XOS降低了在腸道結腸炎發(fā)病早期的腸道粘液的細菌滲透率;XOS的作用與結腸中LC3II/I的表達回復和p62及beclin-1的表達減少有關(guān)。因此XOS降低了結腸粘液微生物群的滲透,并恢復了自噬的功能,表明XOS可能是一種潛在的膳食補充劑或功能食品,可用于IBD的早期管理。
參考資料: Chen Z, Shen X, Zhou Q; et al. Dietary xylo-oligosaccharide ameliorates colonic mucus microbiota penetration with restored autophagy in interleukin-10 gene-deficient mice.[J].JPEN. Journal of parenteral and enteral nutrition,2021,Vol.46(5): 1130-1140. |