試驗目的

本試驗旨在研究XOS對氧化魚(yú)油(OFO)引起的蛋雞腸道黏膜屏障損傷和微生物菌群失調的緩解作用。

試驗設計

選取50周齡海蘭褐蛋雞384只，隨機分為4組，每組8個(gè)重復(以相鄰4個(gè)籠子中的12只雞作為一個(gè)重復)。在所有的重復中，蛋雞的初始體重和產(chǎn)蛋量相近。新鮮魚(yú)油組（FFO組）飼喂添加20 g/kg新鮮魚(yú)油的飼糧；氧化魚(yú)油組（OFO組）飼糧中添加20 g/kg氧化魚(yú)油；OFO/XOS₂₀₀組，飼糧中添加20 g/kg氧化魚(yú)油和200 mg/kg XOS；OFO/XOS₄₀₀組飼糧中添加20 g/kg氧化魚(yú)油和400 mg/kg XOS。

氧化魚(yú)油的制備方法是：新鮮魚(yú)油（FFO）在90℃下加熱并充分曝氣72 h。新鮮魚(yú)油和氧化魚(yú)油的過(guò)氧化值分別為3.20和22.25 meq/kg。低聚木糖（XOS 95P）純度95%。以等量替代玉米的方式在飼料中添加XOS。試驗飼糧的成分見(jiàn)表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的目的基因[緊密連接蛋白-2(ZO2)，緊密連接蛋白1抗體(CLDN1)，緊密連接蛋白5抗體(CLDN5)]和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的引物序列如表2所示。

試驗結果

（1）生產(chǎn)性能

整個(gè)試驗期間沒(méi)有蛋雞死亡。如表3所示，在試驗的第7~12周，OFO組的產(chǎn)蛋量（EP）較低(P<0.05)，且在第7~12周和第1~12周，OFO組的飼料轉化率（FCR）較FFO組低(P<0.10)。而在第7~12周和第1~12周，FFO組、OFO/XOS₂₀₀組和OFO/XOS₄₀₀組的EP和FCR均無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)。受雞舍溫度影響，所有蛋雞前6周產(chǎn)蛋量均低于后6周。

（2）回腸的形態(tài)

飼喂試驗飼糧的蛋雞回腸形態(tài)見(jiàn)表4。FFO組與OFO組回腸絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD）、絨毛高度與窩深之比（VCR）、杯狀細胞數（GCN）無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)。OFO/XOS₄₀₀組回腸VH、VCR和GCN均高于其他組(P<0.05)。

（3）回腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血清內毒素的濃度

第12周時(shí)蛋雞回腸黏膜sIgA含量如圖1A所示。與FFO組相比，OFO和OFO/XOS₂₀₀組蛋雞回腸黏膜sIgA含量顯著(zhù)降低(P<0.05)，但OFO/XOS₄₀₀組比OFO組高(P<0.05)。如圖1B所示，添加400 mg/kg XOS可降低氧化魚(yú)油飼糧引起的血清內毒素濃度升高(P<0.05)，FFO組與OFO/XOS₄₀₀組間無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)。

（4）緊密連接蛋白的相對mRNA表達

如圖1C所示，與FFO組相比，OFO組各層回腸黏膜緊密連接蛋白1抗體(CLDN1)和緊密連接蛋白5抗體(CLDN5)的相對表達量降低(P<0.05)；然而，與OFO組相比，OFO/XOS₄₀₀組的相對表達均有所增加(P<0.05)。

（5）腸道菌群的多樣性

如圖2所示，采用Shannon、Simpson、Ace和Chao多樣性和豐富度指數對盲腸菌群細菌alpha多樣性進(jìn)行了估算。3組間Shannon和Simpson指數差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。添加X(jué)OS(400mg/kg)提高了飼喂氧化魚(yú)油的蛋雞盲腸微生物區系Ace(P=0.028)和Chao(P=0.084)指數。如圖3A，基于未加權UniFrac距離的主坐標分析(PCoA)顯示，3組間的微生物群落分離(PCo1，15.88%；PCo2，13.73%)。如圖3B，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)圖還定義了不同組的樣本占據不同位置的組(COMP1，11.29%；COMP2，6.44%)。

（6）腸道菌群組成

采用RDA分類(lèi)器在不同水平上分析盲腸菌群的分類(lèi)組成。如圖4A所示，所有類(lèi)群的優(yōu)勢門(mén)均為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，其占整個(gè)門(mén)的比例大于88%。與FFO組相比，飼喂OFO的蛋雞中擬桿菌門(mén)豐度較高，厚壁菌門(mén)豐度較低。然而，添加XOS逆轉了OFO組的這些變化。

如圖4B所示，在厚壁菌門(mén)中，大部分屬于梭菌綱（Clostridia）、桿菌綱（Bacilli）和革蘭氏陰性菌綱（Negativicutes）。

如圖4C所示，在科水平上，蛋雞盲腸菌群以擬桿菌科（Bacteroidaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）占優(yōu)勢。與FFO組相比，OFO處理降低了疣微菌科（Ruminococcaceae）豐度，理研菌科（Rikenellaceae）豐度增加，而飼糧中添加XOS則在一定程度上提高了疣微菌科豐度。

如圖4D所示，屬水平分析表明，擬桿菌屬（Bacteroides）和理研菌科_RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group）在群落中所占比例最大。理研菌科_RC9_gut_group的豐度在加入OFO的層中增加，而在加入XOS的層中降低。

利用LEfSe分析從門(mén)到屬的水平上鑒定整個(gè)微生物群顯著(zhù)差異豐富的OTU(LDA>2.0)。如圖5所示，FFO組盲腸菌群中均富集了鏈球菌科(鏈球菌屬)、丁酸球菌屬（Butyricicoccus）、瘤胃梭菌屬_5（Ruminiclostridium_5）以及迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)及其衍生物(Elusimicrobibia， Elusimicrobiales，Elusimicrobiaceae，Elusimicrobium)。OFO組雞的消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、丁酸弧菌屬（Butyricimonas）和多形性糞球菌（Faecalicoccus）的豐度均增加。

在OFO/XOS₄₀₀組中，LEfSe突出顯示大量富集于盲腸的細菌成員，其中一些細菌占了更大的比例，LDA評分更高，如疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）及其衍生物(疣微菌綱（Verrucomicrobiae），疣微菌目（Verrucomicrobiales）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、阿克曼菌屬（Akkermansia）)以及帕拉普雷沃特氏菌屬（Paraprevotella），普氏菌屬_9（Prevotella_9），顫螺旋菌屬（Oscillospira）。

如表5所示，進(jìn)一步采用威爾科克森秩和檢驗揭示微生物組成的差異。與FFO組比較，OFO組雞的盲腸微生物區系疣微菌門(mén)(阿克曼菌屬)、迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobium)和疣微菌科_UCG-008（Ruminococcaceae_UCG-008）的豐度較低(P<0.05)。此外，OFO處理組的梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）豐度高于FFO組(P<0.05)。

添加X(jué)OS后疣微菌門(mén)(疣微菌科，阿克曼菌屬)、帕拉普雷沃特氏菌屬（Paraprevotella）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）和疣微菌科_UCG-013（Ruminococcaceae_UCG-013）的豐度有所升高(P<0.05)，而丹毒梭菌（Erysipelatoclostridium）的豐度較OFO組有所降低(P<0.05)。

（7）系統類(lèi)型與表型的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析方法分析蛋雞盲腸菌群系統類(lèi)型與表型之間的關(guān)系。如圖6A所示，疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）的豐度與回腸絨毛高度（VH）及回腸黏膜緊密連接蛋白1抗體（CLDN1）的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）豐度與回腸絨隱比（VCR）及回腸黏膜分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量呈負相關(guān)(P<0.05)。迷蹤菌門(mén)（Elusimicrobia）與CLDN1(P<0.05)、緊密連接蛋白5抗體（CLDN5）表達呈顯著(zhù)正相關(guān)(P<0.01)，與血清內毒素濃度呈顯著(zhù)負相關(guān)(P<0.05)。

如圖6B所示，在盲腸菌群屬水平上，丹毒梭菌（Erysipelatoclostridium）、圖靈桿菌（Turicibacter）和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）的一個(gè)未分類(lèi)成員的豐度與回腸VH、VCR、杯狀細胞數（GCN）、sIgA濃度，以及回腸黏膜緊密連接蛋白-2（ZO2）、CLDAN1、CLDN5的表達呈負相關(guān)(P<0.05)。相反，顫螺旋菌屬（Oscillospira）、帕拉普雷沃特氏菌屬（Paraprevotella）和疣微菌科_UCG-008（R.UCG-008）的豐度與回腸VH和/或GCN呈正相關(guān)(P<0.05)。此外，阿克曼菌屬（Akkermansia）的相對豐度也與回腸VH、ZO2和CLDN1的表達呈正相關(guān)(P<0.05)，而丁酸弧菌屬（Butyricimonas）與回腸黏膜CLDN1、CLDN5的表達及sIgA濃度呈負相關(guān)(P<0.05)。Elusimicrobium豐度與回腸黏膜CLDN1(P<0.05)和CLDN5表達呈顯著(zhù)正相關(guān)(P<0.01)，與血清內毒素含量呈顯著(zhù)負相關(guān)(P<0.05)。

結論

添加XOS可減輕OFO對蛋雞生產(chǎn)性能的損害，并通過(guò)緩解腸道黏膜屏障功能障礙強化回腸形態(tài)，這可能與增加微生物豐富度和重塑微生物組成有關(guān)。本研究將拓展我們對腸道微生物在通過(guò)膳食干預調節腸道黏膜屏障中的作用的認識，有助于提高XOS在雞肉生產(chǎn)中的應用效率。

參考文獻：

Jian-Min Zhou, Hai-Jun Zhang, Shu-Geng Wu, Kai Qiu, Yu Fu, Guang-Hai Qi, Jing Wang.Supplemental Xylooligosaccharide Modulates Intestinal Mucosal Barrier and Cecal Microbiota in Laying Hens Fed Oxidized Fish Oil[J].Frontiers in microbiology,2021,Vol.12: 635333.