試驗設計 選擇24只雄性無(wú)特定病原體的(SPF)C57BL/6NTac(B6)小鼠(Taconic)作為研究對象,小鼠被分為2組,飼養在我們的動(dòng)物設施中,每個(gè)籠子6只小鼠。實(shí)驗組從3周齡開(kāi)始,以多糖為基質(zhì),自由飲食補充有10% XOS的Altromin C1000鼠糧,對照組則是自由飲食不添加任何補充物的Altromin C1000鼠糧;在喂食XOS飲食10周后,對所有小鼠進(jìn)行稱(chēng)重;在11周齡時(shí),從每只小鼠中采集20 mL全血,從臉頰上的頸靜脈交界處提取RNA;所有小鼠在13周齡時(shí)都被麻醉,然后用頸椎脫位法處死;小鼠被處死后,收集糞便和盲腸內容物并儲存在-80°C,直到提取DNA,并通過(guò)qPCR進(jìn)行細菌圖譜分析,和基因表達分析。 試驗結果 (1)膳食XOS增加了整個(gè)小鼠腸道的雙歧桿菌屬 如表1所示,未發(fā)現XOS飲食對任何消化道節段的擬桿菌門(mén)有顯著(zhù)的影響,喂食XOS小鼠的盲腸內容物中厚壁菌門(mén)的細菌數量比對照組喂養的小鼠高1.3倍(P<0.01);乳酸菌,屬于厚壁菌門(mén)中的一個(gè)屬,在喂食XOS小鼠的盲腸中含量明顯比對照組高5.2倍(P< 0.05)。此外,在所有測試的腸道切片中,喂食XOS小鼠的雙歧桿菌數量都有顯著(zhù)增加(P<0.01),且盲腸內容物中的雙歧桿菌含量高出對照組47倍。 如圖1所示,在喂食XOS后,回腸中雙歧桿菌的比例最高;在對照組中,雙歧桿菌和乳酸菌都占十二指腸總微生物群的3%;在回腸中分別占8%和15%;在大腸中,這些菌屬的比例不超過(guò)0.5%。以上實(shí)驗數據表明XOS不僅在結腸和盲腸中發(fā)酵,而且在小腸中也對微生物群產(chǎn)生了影響。 為了消除體重這一可能的混雜因素,在小鼠10周齡時(shí)對其進(jìn)行稱(chēng)重,沒(méi)有觀(guān)察到體重的差異;XOS組的體重為25.3±0.3克,對照組的體重為24.5±0.4克。 (2)膳食XOS誘導了抗菌蛋白RegIIIγ的局部表達 如圖2A所示,與對照組小鼠相比,喂食XOS的小鼠十二指腸和回腸IECs中的RegIIIγ都顯著(zhù)被上調了(P<0.01)(圖2A)。如圖2B所示,編碼GPR43受體的Ffar2的基因表達也在小腸和大腸的腸細胞中進(jìn)行了分析。在mRNA水平上,XOS組和對照組之間沒(méi)有發(fā)現差異,表明該受體的從頭合成不受XOS飲食的影響。如圖2C所示,為了研究IECs的局部先天免疫反應,分析了Tnf、Il18、Cxcl1和Cxcl2在小腸和大腸的腸細胞中的表達;編碼角化細胞源性趨化因子(KC)的Cxcl1的表達,是小鼠吸引中性粒細胞的重要趨化因子,與未處理組相比,XOS組中從十二指腸分離的IECs顯著(zhù)增加(P<0.05),而兩組間回腸的表達無(wú)差異。與對照組相比,XOS喂養小鼠的所有腸細胞中促炎細胞因子TNF-α和IL-18以及趨化因子CXCL2(巨噬細胞炎癥蛋白2)的mRNA水平都不受影響。 如圖3所示,XOS組回腸上皮細胞中Slc9a3的表達往往大于對照組(P=0.06),這僅僅表明喂食XOS小鼠的小腸對SCFAs的吸收增加。
(3)在喂食XOS的小鼠中,免疫相關(guān)基因的系統性表達發(fā)生了變化 如圖4A所示,為了證明XOS可能具有的系統性抗炎作用,我們在10周齡時(shí)測量了全血中Il1β的表達,發(fā)現XOS組的表達量顯著(zhù)低于對照組(P<0.01)。一些細胞因子,包括1型和2型IFN,刺激中性粒細胞誘導促炎細胞因子的表達,IL-18刺激NK細胞和T細胞產(chǎn)生了IFN-γ;如圖4B所示,為了評估這種刺激是否也受到XOS干預的影響,測定了Ifnγ的表達,結果發(fā)現XOS組小鼠的全血中Ifnγ的表達顯著(zhù)少于對照小鼠(P<0.05);如圖4C和4D所示,全血中IL-18和Ffar2的表達量在XOS組比對照組更大,但組間差異不明顯(分別為P=0.05和P=0.09)。 如圖5A所示,發(fā)現Il1β和Ffar2的表達被5-10 mmol/L的丙酸以劑量依賴(lài)的方式下調,而用乙酸處理與未處理的樣品沒(méi)有明顯的差異(P=0.28)。如圖5B和5D所示,與處理過(guò)的樣品相比,在血液中加入丙酸后,Ifnγ和Il18的表達被下調;然而僅在加入10 mmol/L丙酸后,Il18的表達才與未處理的樣品有顯著(zhù)差異(P<0.01)。
(4)補充XOS的飲食減少了促炎細胞因子的局部產(chǎn)生 為了研究XOS飲食的局部和全身適應性免疫反應,特別是IFN-γ,在XOS處理后在血液中的表達減少,從脾臟和MLN中分離出細胞,用流式細胞儀進(jìn)行分析。與對照組小鼠(所有CD4+T細胞為1.8±0.2%)相比,XOS喂養的小鼠MLN中產(chǎn)生IFNγ的T細胞比例較低(P<0.01),這表明對這種促炎細胞因子有局部下調作用;研究了雙歧因子X(jué)OS處理對產(chǎn)生IL-10的Treg細胞的抗炎作用,然而在MLNs或脾臟的抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生方面,兩組之間沒(méi)有發(fā)現顯著(zhù)的差異;對于FoxP3+ Treg細胞和已知可誘導Treg細胞的耐受性CD103+ DCs的水平也得到了類(lèi)似的結果,這表明雙歧桿菌比例的增加沒(méi)有直接接觸和影響這些調節性免疫細胞區間。 試驗結論 本研究表明雙歧因子XOS不僅在結腸而且在整個(gè)小腸中也增加了雙歧桿菌的數量;防御素再生胰島衍生蛋白3γ(RegIIIγ)的上調可能是作為一種保護,防止細菌與粘膜屏障之間相互作用的增加。因此,XOS分解發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs可能是血液中觀(guān)察到的IL-1β和其他促炎細胞因子表達減少的間接原因。
參考資料: Hansen C H F , Hanne Fr?ki?r, Christensen A G , et al. Dietary Xylooligosaccharide Downregulates IFN-γ and the Low-Grade Inflammatory Cytokine IL-1β Systemically in Mice[J]. Journal of Nutrition, 2013, 143(4):533-540. |