試驗設計

選擇24只雄性無(wú)特定病原體的（SPF）C57BL/6NTac（B6）小鼠（Taconic）作為研究對象，小鼠被分為2組，飼養在我們的動(dòng)物設施中，每個(gè)籠子6只小鼠。實(shí)驗組從3周齡開(kāi)始，以多糖為基質(zhì)，自由飲食補充有10% XOS的Altromin C1000鼠糧，對照組則是自由飲食不添加任何補充物的Altromin C1000鼠糧；在喂食XOS飲食10周后，對所有小鼠進(jìn)行稱(chēng)重；在11周齡時(shí)，從每只小鼠中采集20 mL全血，從臉頰上的頸靜脈交界處提取RNA；所有小鼠在13周齡時(shí)都被麻醉，然后用頸椎脫位法處死；小鼠被處死后，收集糞便和盲腸內容物并儲存在-80°C，直到提取DNA，并通過(guò)qPCR進(jìn)行細菌圖譜分析，和基因表達分析。

試驗結果

（1）膳食XOS增加了整個(gè)小鼠腸道的雙歧桿菌屬

如表1所示，未發(fā)現XOS飲食對任何消化道節段的擬桿菌門(mén)有顯著(zhù)的影響，喂食XOS小鼠的盲腸內容物中厚壁菌門(mén)的細菌數量比對照組喂養的小鼠高1.3倍（P<0.01）；乳酸菌，屬于厚壁菌門(mén)中的一個(gè)屬，在喂食XOS小鼠的盲腸中含量明顯比對照組高5.2倍（P< 0.05）。此外，在所有測試的腸道切片中，喂食XOS小鼠的雙歧桿菌數量都有顯著(zhù)增加（P<0.01），且盲腸內容物中的雙歧桿菌含量高出對照組47倍。

如圖1所示，在喂食XOS后，回腸中雙歧桿菌的比例最高；在對照組中，雙歧桿菌和乳酸菌都占十二指腸總微生物群的3%；在回腸中分別占8%和15%；在大腸中，這些菌屬的比例不超過(guò)0.5%。以上實(shí)驗數據表明XOS不僅在結腸和盲腸中發(fā)酵，而且在小腸中也對微生物群產(chǎn)生了影響。

為了消除體重這一可能的混雜因素，在小鼠10周齡時(shí)對其進(jìn)行稱(chēng)重，沒(méi)有觀(guān)察到體重的差異；XOS組的體重為25.3±0.3克，對照組的體重為24.5±0.4克。 

（2）膳食XOS誘導了抗菌蛋白RegIIIγ的局部表達

如圖2A所示，與對照組小鼠相比，喂食XOS的小鼠十二指腸和回腸IECs中的RegIIIγ都顯著(zhù)被上調了（P<0.01）（圖2A）。如圖2B所示，編碼GPR43受體的Ffar2的基因表達也在小腸和大腸的腸細胞中進(jìn)行了分析。在mRNA水平上，XOS組和對照組之間沒(méi)有發(fā)現差異，表明該受體的從頭合成不受XOS飲食的影響。如圖2C所示，為了研究IECs的局部先天免疫反應，分析了Tnf、Il18、Cxcl1和Cxcl2在小腸和大腸的腸細胞中的表達；編碼角化細胞源性趨化因子（KC）的Cxcl1的表達，是小鼠吸引中性粒細胞的重要趨化因子，與未處理組相比，XOS組中從十二指腸分離的IECs顯著(zhù)增加（P<0.05），而兩組間回腸的表達無(wú)差異。與對照組相比，XOS喂養小鼠的所有腸細胞中促炎細胞因子TNF-α和IL-18以及趨化因子CXCL2（巨噬細胞炎癥蛋白2）的mRNA水平都不受影響。

如圖3所示，XOS組回腸上皮細胞中Slc9a3的表達往往大于對照組（P=0.06），這僅僅表明喂食XOS小鼠的小腸對SCFAs的吸收增加。

（3）在喂食XOS的小鼠中，免疫相關(guān)基因的系統性表達發(fā)生了變化

如圖4A所示，為了證明XOS可能具有的系統性抗炎作用，我們在10周齡時(shí)測量了全血中Il1β的表達，發(fā)現XOS組的表達量顯著(zhù)低于對照組（P<0.01）。一些細胞因子，包括1型和2型IFN，刺激中性粒細胞誘導促炎細胞因子的表達，IL-18刺激NK細胞和T細胞產(chǎn)生了IFN-γ；如圖4B所示，為了評估這種刺激是否也受到XOS干預的影響，測定了Ifnγ的表達，結果發(fā)現XOS組小鼠的全血中Ifnγ的表達顯著(zhù)少于對照小鼠（P<0.05）；如圖4C和4D所示，全血中IL-18和Ffar2的表達量在XOS組比對照組更大，但組間差異不明顯（分別為P=0.05和P=0.09）。

如圖5A所示，發(fā)現Il1β和Ffar2的表達被5-10 mmol/L的丙酸以劑量依賴(lài)的方式下調，而用乙酸處理與未處理的樣品沒(méi)有明顯的差異（P=0.28）。如圖5B和5D所示，與處理過(guò)的樣品相比，在血液中加入丙酸后，Ifnγ和Il18的表達被下調；然而僅在加入10 mmol/L丙酸后，Il18的表達才與未處理的樣品有顯著(zhù)差異（P<0.01）。

（4）補充XOS的飲食減少了促炎細胞因子的局部產(chǎn)生

為了研究XOS飲食的局部和全身適應性免疫反應，特別是IFN-γ，在XOS處理后在血液中的表達減少，從脾臟和MLN中分離出細胞，用流式細胞儀進(jìn)行分析。與對照組小鼠（所有CD4+T細胞為1.8±0.2%）相比，XOS喂養的小鼠MLN中產(chǎn)生IFNγ的T細胞比例較低（P<0.01），這表明對這種促炎細胞因子有局部下調作用；研究了雙歧因子X(jué)OS處理對產(chǎn)生IL-10的Treg細胞的抗炎作用，然而在MLNs或脾臟的抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生方面，兩組之間沒(méi)有發(fā)現顯著(zhù)的差異；對于FoxP3+ Treg細胞和已知可誘導Treg細胞的耐受性CD103+ DCs的水平也得到了類(lèi)似的結果，這表明雙歧桿菌比例的增加沒(méi)有直接接觸和影響這些調節性免疫細胞區間。

試驗結論

本研究表明雙歧因子XOS不僅在結腸而且在整個(gè)小腸中也增加了雙歧桿菌的數量；防御素再生胰島衍生蛋白3γ（RegIIIγ）的上調可能是作為一種保護，防止細菌與粘膜屏障之間相互作用的增加。因此，XOS分解發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs可能是血液中觀(guān)察到的IL-1β和其他促炎細胞因子表達減少的間接原因。

參考資料：

Hansen C H F , Hanne Fr?ki?r,  Christensen A G , et al. Dietary Xylooligosaccharide Downregulates IFN-γ and the Low-Grade Inflammatory Cytokine IL-1β Systemically in Mice[J]. Journal of Nutrition, 2013, 143(4):533-540.