試驗設計

試驗樣品：Plexus Worldwide（Scottsdale，USA）提供了Slim，以每天1594 mg的劑量進(jìn)行測試，其中包含1000 mg的益生元XOS和531 mg的多酚混合物，其中包含500 mg的綠咖啡提取物（至少含50％的羥基檸檬酸），藤黃果提取物20毫克（含50％檸檬酸），α-硫辛酸10毫克和桑葚果實(shí)提取物1毫克。

實(shí)驗設計：

（1）短期結腸培養：以5位不同健康人類(lèi)的糞便（供體A：女性，27歲；B：女性，24歲；C：男性，21歲；D：男性，32歲；E：男性，24歲）作為供體。在結腸培養開(kāi)始時(shí)，將試驗樣品（0mg或1594mg）加入到無(wú)糖的基礎培養基中，得到的最終濃度分別為0g/L（空白對照）或2.66g/L（Slim）；之后通過(guò)將新鮮采集的糞便樣本與厭氧磷酸鹽緩沖液以1:5（m:v）的比例混合，為不同的人類(lèi)志愿者制備糞便接種液，然后均質(zhì)化10分鐘并通過(guò)離心去除大顆粒（2分鐘，500克）后，將糞便接種物（1:10）分別加入到培養基中，培養時(shí)間為48小時(shí)，溫度為37℃，持續搖晃（90rpm），所有實(shí)驗均重復三次。

（2）人類(lèi)腸道微生物生態(tài)系統模擬器（SHIME®）：SHIME由五個(gè)反應器組成，這些反應器模擬了人體胃腸道的不同部分：胃，小腸和三個(gè)結腸區域。在接種健康人類(lèi)志愿者（男性，32歲）的糞便微生物群后，結腸隔室模擬升結腸（AC），橫結腸（TC）和降結腸（DC）。SHIME運行的實(shí)驗設置包括兩個(gè)星期的啟動(dòng)期，兩個(gè)星期的對照期和三個(gè)星期的干預期，在干預期間，每天將1594 mg/d劑量的試驗樣品與食物一起服用。

檢測指標：短期結腸培養，在結腸培養0h和48h后進(jìn)行pH、氣體、SCFA和乳酸（LA）測量；SHIME實(shí)驗期間，每周收集三次微生物代謝活動(dòng)的樣本，并對微生物群落進(jìn)行分析，同時(shí)檢測上皮細胞和巨噬細胞共培養模型中對宿主細胞的影響。  

試驗結果

（1）供體選擇

由表1可知，5個(gè)供體產(chǎn)生的氣體、乳酸和SCFA（其中包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽）含量增加，pH值和支鏈SCFA降低；此外，由于在不同的供體中測試產(chǎn)品發(fā)酵后觀(guān)察到的趨勢相似，因此選擇了具有高代謝活性的供體D作為長(cháng)期的SHIME實(shí)驗。

（2）微生物代謝活性分析

由圖1可知，試驗樣品干預后AC、TC和DC的堿消耗量增加，分別為7.44（±3.19）、4.86（±4.17）和1.98（±1.38）mL/day；試驗樣品導致所有結腸區域的乙酸產(chǎn)生增加，其中對升結腸的影響具有統計學(xué)意義（P<0.01），即增加2.7mM（+13%）；此外，丙酸在三個(gè)結腸區域都有增加（p < 0.001），即在A(yíng)C、TC和DC中分別增加了2.1mM（+19%）、3.4mM（+24%）和4.1mM（+30%）；AC和TC中的丁酸鹽產(chǎn)量顯著(zhù)增加（P<0.01），其中AC中的丁酸鹽影響最為顯著(zhù)（+7mM（+84%））。

由圖2可知，試驗樣品的干預對整個(gè)模擬結腸中的乳酸產(chǎn)生有輕微影響。在A(yíng)C（+0.35 mM）中觀(guān)察到顯著(zhù)的乳酸積累，而在TC和DC中乳酸水平保持不變。

（3）微生物群落組成分析

由表2可知，為了評估試驗樣品對相關(guān)分類(lèi)群（雙歧桿菌、乳酸菌、嗜粘蛋白-阿克曼菌、擬桿菌和厚壁菌門(mén)）的影響，對腔內微生物群進(jìn)行了qPCR分析。在干預期間，AC和TC的腔內環(huán)境中的嗜粘蛋白-阿克曼菌含量增加（AC中從定量限以下到7.15 log/mL，TC中平均為+0.5 log/mL）；干預的第二周和第三周，在A(yíng)C中其水平升高，而在干預的第一周，TC中觀(guān)察到直接的干預效果（+0.75 log（或+ 8％））。

試驗樣品干預后，在AC的腔內環(huán)境中，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)大幅增加，特別是在干預的第二周和第三周（兩個(gè)門(mén)至少+1.5 log/mL（+15%）；腔內厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)水平在TC和DC中不受影響。

經(jīng)過(guò)適應期后，在干預的第二和第三周，乳酸菌和雙歧桿菌在AC的腔內受到刺激（兩個(gè)菌屬都超過(guò)了+2.5 log/mL（>30%））；在TC中也觀(guān)察到乳酸菌屬的腔內增加，但沒(méi)有AC中那么明顯（+0.4 log/mL）。如圖3所示，腔內乳酸菌群落主要由與三個(gè)不同物種有關(guān)的操作分類(lèi)單位（OTU）主導，即植物乳桿菌、Lactobacillus oris和Lactobacillus antri；在干預期間，植物乳桿菌在三個(gè)結腸區域的相對豐度趨向于增加到19-33%

（4）對上皮細胞和巨噬細胞共培養模型中宿主細胞的影響

如圖4a所示，通過(guò)測量Caco-2細胞的TEER作為腸道屏障功能的量度，所有的產(chǎn)品都能保持TEER值接近100%；采用試驗樣品干預后，TC的TEER趨于增加（+9.7%），DC的TEER也有顯著(zhù)的增加（+18.5%）。此外，如圖4h所示，與各自的對照組相比，在TC和DC中的干預期之后，LPS誘導的THP1巨噬細胞的NF-κB轉錄活性更加明顯。如圖4b-4g所示，在細胞因子水平方面，TC和DC中干預期后LPS誘導的IL-10和IL-6顯著(zhù)增加（即IL6，TC+2.5倍，在DC中+3.2倍；IL10，在TC中+2.3倍，在DC中+2.7倍）；與相應的對照組相比，試驗樣品干預可誘導較少的IL-1β（在TC和DC中）和較多的IL-8（僅在TC中顯著(zhù)），并增加DC中的CXCL10水平；然而相比于對照產(chǎn)品，TNF-α在A(yíng)C中觀(guān)察到減少，而在TC和DC中觀(guān)察到增加。

試驗結論

采用經(jīng)驗證的體外腸道模型（即SHIME®模型），結合上皮細胞和巨噬細胞的共培養，研究長(cháng)期服用低聚木糖/多酚混合物的益生元潛力和免疫調節作用，結果發(fā)現該混合物沿整個(gè)結腸良好發(fā)酵，導致升結腸中丁酸鹽（+7 mmol/L）的產(chǎn)生增加；橫結腸中乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的產(chǎn)生增加（每種大約+4 mmol/L）；降結腸中丙酸鹽的產(chǎn)生也增加（+4.1 mmol/L）；升結腸中銨減少和乳酸水平升高，這與乳酸桿菌和雙歧桿菌的增加相關(guān)（+2.5 Log/mL）。此外，近端結腸管腔中產(chǎn)丙酸的嗜粘蛋白-阿克曼菌增加（高達7.15log/mL）；同時(shí)觀(guān)察到對遠端結腸的Caco-2屏障功能有保護作用，并有明顯的免疫激活特性 。

參考資料：

Van, den, Abbeele, et al. A combination of xylooligosaccharides and a polyphenol blend affect microbial composition and activity in the distal colon exerting immunomodulating properties on human cells[J]. Journal of Functional Foods, 2018.