試驗設計

       試驗對象：7周齡的C57BL / 6J雄性小鼠。

       試驗方法: 將小鼠隨機分為6組，在前3周，三組飼喂AIN93M日糧（對照組），另外三組飼喂輔以0.2%腺嘌呤的AIN93M飲食以誘導CKD。在第三周結束時(shí)，停止腺嘌呤治療，對照組（CNTR）和CKD小鼠接受補充低劑量（2％，XLD）或高劑量XOS（7％，XHD）的AIN93M飲食或對照AIN93M飲食，再喂養3周，實(shí)驗設計流程見(jiàn)圖1A。在第6周結束時(shí)，處死小鼠，收集血清和組織，檢測腎臟標志物、炎癥水平、尿毒癥毒素、盲腸微生物組成和短鏈脂肪酸濃度等，并對腎臟進(jìn)行組織學(xué)分析。

試驗結果

（1）膳食XOS對腺嘌呤誘導的腎臟損傷的影響

       干預前：用腺嘌呤處理3周后，小鼠出現急性腎損傷，表現為血尿素氮（BUN）和肌酐水平升高，炎癥和纖維化標志物的基因表達增加，水腫導致腎臟增大，體重減輕（圖1A和圖2）。將飲食改為不含腺嘌呤的對照飲食飼喂3周后，持續的腎臟損傷表現為BUN和肌酐水平持續升高（圖1D，E）；組織病理學(xué)特征包括皮質(zhì)的腎小管面積減少，腎小管擴張，局灶性腎小管上皮損傷/壞死，炎癥細胞浸潤和輕度纖維化（圖2A、C、D），以及炎癥細胞因子（Il6、Tnfα和Mcp1）、M2巨噬細胞（Fizz-1、Arg和Ym1）和纖維化標志物（Col1A1和結締組織生長(cháng)因子[Ctgf]）的基因表達增加（圖4）。

       干預后：在CKD小鼠中，XOS（2％和7％）的干預降低了BUN和肌酐水平（圖1B、D、E），并促進(jìn)了腎小管的再生（圖2B、E、F）。通過(guò)Masson's trichrome染色和纖維化標志物Col1A1和Ctgf的基因表達，XOS（2%和7%）的處理減少了CKD小鼠的間質(zhì)纖維化（圖3和4A、B）。在CKD小鼠中，Il-6和Fizz-1的表達水平也因XOS的干預而顯著(zhù)下降（圖4C、F）。

（2）膳食XOS對盲腸中微生物組成的影響

       對照組（CNTR）和CKD小鼠的α多樣性指數（Chao1和Shannon）相似（圖5A、B），而飼喂含7%XOS的飲食后，CKD小鼠的物種豐富度（Chao1）顯著(zhù)下降（圖5A）。當使用由β多樣性分析產(chǎn)生的未加權和加權UniFrac距離指標來(lái)檢測組間距離時(shí)，不同實(shí)驗組的小鼠傾向于形成不同的聚類(lèi)（圖5C、D）。

       在門(mén)水平上，在第6周結束時(shí)，對照組和CKD小鼠之間的細菌豐度無(wú)顯著(zhù)性差異（表1）。XOS干預后，放線(xiàn)菌門(mén)的豐度在對照組和CKD小鼠中都表現出下降的趨勢（表1）。

       在屬水平上，共有9個(gè)菌屬在CKD小鼠中富集（圖6A），補充XOS后顯著(zhù)降低了6個(gè)菌屬的豐度，包括Clostridium, unclassi?ed Erysipelotrichaceaegenus、Staphylococcus、Dorea、Allobaculum和乳酸菌屬（圖6B、D、F-I），但沒(méi)有降低Coprobacillus、Ruminococcus和Blautia（圖6C、E、J）。

（3）XOS干預對CKD小鼠盲腸細菌預測功能的影響

       如圖7A所示，對照組小鼠的盲腸細菌顯示出豐富的細胞運動(dòng)和信號轉導KEGG通路，而CKD小鼠的盲腸細菌富含12條特征性的KEGG通路。在這12條途徑中，有10條在低劑量和/或高劑量XOS的補充下有所減少，包括癌癥、碳水化合物代謝、遺傳信息處理、免疫系統、傳染病、代謝性疾病、信號分子和相互作用、萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物的代謝、翻譯、復制和修復（圖7B-M）。

（4）盲腸短鏈脂肪酸濃度

       對照組和CKD小鼠盲腸中短鏈脂肪酸的濃度無(wú)顯著(zhù)差異，兩種劑量XOS處理的CNTR小鼠和高劑量XOS處理的CKD小鼠都導致了盲腸SCFAs總量、乙酸和丁酸濃度的增加（表2）。在CNTR小鼠中，XOS增加了丙酸的濃度，但對CKD小鼠沒(méi)有影響（表2）。在CNTR和CKD小鼠中，XOS的補充沒(méi)有改變血清中SCFAs的濃度（表3）。然而，與CNTR小鼠相比，無(wú)論是否補充XOS，CKD小鼠血液中的丁酸水平顯著(zhù)升高，而丙酸濃度則顯著(zhù)降低（表3）。

（5）XOS干預對尿毒癥毒素的影響

       與對照組相比，CKD小鼠血清中硫酸吲哚鹽和對硫甲酚的水平顯著(zhù)升高（圖8A、B），XOS的干預完全地降低了對照組和CKD小鼠血清中的對硫甲酚的濃度。對硫甲酚來(lái)源于大腸中酪氨酸的細菌發(fā)酵/代謝。使用PICRUSt評估因細菌組成變化引起的代謝變化，證實(shí)CKD小鼠的酪氨酸代謝顯著(zhù)增加，而XOS的干預扭轉了這種趨勢（圖8A、C）。

（6）腎功能與盲腸細菌、循環(huán)和盲腸SCFAs的關(guān)系 

       11種細菌與BUN（圖9）、12種細菌與血清肌酐（圖10）之間存在顯著(zhù)的正相關(guān)關(guān)系。其中有9種細菌與BUN和血清肌酐水平都呈正相關(guān)，包括Peptostreptococcaceae、Staphylococcus、Ruminococcus、乳桿菌屬、Mogibacteriaceae、Clostridiaceae、Dorea、Coprobacillus、Blautia、Clostridium和Erysipelotrichaceae；Dehalobacterium屬與BUN呈顯著(zhù)負相關(guān)關(guān)系。血清中的丙酸以及盲腸中的SCFAs與BUN和血清肌酐呈負相關(guān)關(guān)系。然而，血液循環(huán)中的丁酸與BUN和血清肌酐之間有很強的正相關(guān)關(guān)系。

（7）XOS干預對微生物防御相關(guān)基因表達的影響

       與CNTR小鼠相比，CKD小鼠回腸中抗菌肽（Defa5）的基因表達明顯較高，被XOS處理后有下降的趨勢（圖121A）。未分類(lèi)的S24-7屬的相對豐度與Defa5的表達水平成反比（圖11E）。

試驗結論

       試驗表明，益生元XOS干預可以改善CKD小鼠的腎功能，并可引起盲腸菌群組成和功能的顯著(zhù)變化。通過(guò)改善腸道微生物群、提高SCFA濃度和減少細菌性尿毒癥毒素，飲食XOS干預可能是緩解CKD進(jìn)展的潛在治療方法。

參考資料：

Jieping Yang, Qing Li.et al. Effects of Prebiotic Fiber Xylooligosaccharide in Adenine-Induced Nephropathy in Mice[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 62, 1613-4125, 2018