試驗設計 原料：乳雙歧桿菌MN-Gup；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、菊粉純度均為85%~90%，低聚甘露糖。 益生菌增殖活性的測定：將保存的乳雙歧桿菌MN-Gup菌株在無(wú)菌條件下接種到MRS完全培養基，于37℃下培養活化24 h，然后再接種到MRS完全培養基中繼續培養活化24 h，重復以上步驟活化3代，待菌種充分恢復活力后，取含有10 mL MRS培養基的試管接種MN-Gup活化菌液，接種后使樣品中菌液濃度為1×108 cfu/mL，然后分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，設定添加1.5%葡萄糖和無(wú)碳源培養基為對照組，厭氧培養24 h，用益生指數（PI）來(lái)表示每種益生元的益生活性。 腸道微生態(tài)體外模擬模型的建立：配制結腸模擬發(fā)酵液，按質(zhì)量比分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混勻后滅菌備用。 取3名成年人糞便稱(chēng)重，混合后按1:5質(zhì)量比用生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)鰷u震蕩，經(jīng)500 g離心5 min去除大的沉淀物，得菌群懸液，按8:1:1體積比依次添加結腸發(fā)酵液、菌群懸液和MN-Gup菌體懸液，使每組MN-Gup終濃度為1×108 cfu/mL，然后以搖床37℃、轉速90厭氧培養8 h，按DNA提取試劑盒操作步驟提取發(fā)酵液總DNA，并測定其DNA濃度。 腸道菌群增殖測定：按表1所示設計引物，取合成的擬桿菌屬（Bacteroidetes）、厚壁菌屬（Firmicutes）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp）、乳桿菌屬（Lactobacillus spp）和阿克曼菌屬（Akkermansia muciniphila）的標準質(zhì)粒模板，按10倍比例稀釋為8個(gè)點(diǎn)，按1 μL模板、上下游引物0.5 μL、8 μL水、10 μL SYBR酶配制成20 μL/孔的反應體系進(jìn)行PCR擴增。以CQ值為縱坐標、模板DNA濃度的Lg值為橫坐標，建立標準曲線(xiàn)。相同條件下，根據下列公式計算樣品中目標菌群的比例。
試驗結果 （1）不同益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的影響 由圖1可知，低聚半乳糖具有更顯著(zhù)的促增殖活性，其PI值為2.18±0.19，其次為低聚木糖，其PI值為1.68±0.15，低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。
（2）不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道益生菌生長(cháng)的影響 由圖2可知，通過(guò)比較乳雙歧桿菌MN-Gup搭配不同益生元組合對糞便菌群中益生菌的影響發(fā)現，低聚木糖組合促雙歧作用顯著(zhù)高于其他益生元，其對雙歧桿菌增殖的促進(jìn)效果是低聚半乳糖的6倍。即在體外模擬腸道微生態(tài)體系下，低聚木糖更適宜作為MN-Gup的合生元來(lái)調節腸道雙歧桿菌，而低聚半乳糖組則顯著(zhù)提高了乳桿菌比例。 本試驗比較單一益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup的益生效果時(shí)發(fā)現低聚半乳糖促增殖最強，而在菌群中低聚木糖對雙歧菌屬的益生效果似乎更顯著(zhù)。這可能是因為菌群中其他種類(lèi)的雙歧桿菌對低聚木糖的利用率更高，具體原因需要進(jìn)一步分析。這也從側面反映出了多菌群體系下研究益生元的益生功能與單菌株發(fā)酵體系是可能存在差異的，相比較而言腸道微生態(tài)模擬體系可能更接近合生元在體內作用時(shí)的真實(shí)環(huán)境。
（3）不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道厚壁/擬桿菌群比例、阿克曼菌（AKK）生長(cháng)的影響 由圖3可知，各合生元組對AKK菌群占比的影響不大，表明這5種低聚糖組合并不會(huì )顯著(zhù)影響AKK菌群的比例；與葡萄糖對照組相比，各合生元組均顯著(zhù)增加了厚壁/擬桿菌群的比值。
試驗結論 本研究設計了基于體外腸道微生態(tài)模擬方法的益生元篩選方法，通過(guò)提取成年人糞便菌群后進(jìn)行體外發(fā)酵，研究比較了不同合生元組合對腸道有益菌和重要菌群的調控作用，并與單菌株發(fā)酵體系的結果進(jìn)行比較，結果發(fā)現低聚木糖與乳雙歧桿菌MN-Gup組合后可顯著(zhù)提升菌群中雙歧桿菌的比例，而單菌株發(fā)酵體系下低聚半乳糖更能促進(jìn)MN-Gup的生長(cháng)；各合生元組合對阿克曼菌的比例并無(wú)顯著(zhù)影響。
參考資料： 李樹(shù)森,肖然,孫二娜,任怡鎂,王辰元.基于體外模擬腸道微生態(tài)系統的乳雙歧桿菌MN-Gup益生元篩選及其發(fā)酵特性研究[J].中國奶牛,2022(08):1-4. |
