試驗設計

 糞便樣本的來(lái)源：5名經(jīng)結腸鏡診斷為臨床緩解期的UC患者和5名健康志愿者，年齡在18至60歲之間，被納入這項病例對照研究。

 發(fā)酵培養基：基礎生長(cháng)培養基（酵母提取物、卡西酮和脂肪酸；YCFA）包含以下化合物：胰蛋白酶，10g/L；酵母提取物，2. 5克/升；L-半胱氨酸，1克/升；NaCl，0.9克/升；CaCl2-6H2O，0.09克/升；KH2PO4，0.45克/升；K2HPO4，0.45克/升；MgSO4-7H2O，0.09克/升；維生素I溶液，200毫升；赫敏溶液，2毫升；加入XOS（Sigma Aldrich，美國）（8克/升）作為唯一的碳源。在加入厭氧條件的指示劑后，將培養基調整到pH值6.5，并將5毫升分裝到一個(gè)10毫升的瓶子里，在高壓滅菌器中消毒前用N2沖洗。

 靜態(tài)發(fā)酵：采集研究對象新鮮的糞便樣品（0.8克）用8毫升0.1M厭氧磷酸鹽緩沖鹽水（pH7.0）均質(zhì)，在糞便樣品到達實(shí)驗室后立即制成10%（w/v）的泥漿。

 將0.5毫升的糞便漿液接種到裝有5毫升生長(cháng)培養基（XOS作為唯一的碳源）的消毒瓶中，在37℃下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48小時(shí)后，對培養基進(jìn)行離心。將培養基的沉淀物儲存在-80℃，用于提取DNA、測序及生物信息學(xué)分析。UC患者和健康志愿者的原始糞便被定義為U_FAE和N_FAE組的樣本，而UC患者在YCFA和含XOS的培養基中的糞便發(fā)酵沉淀樣本被定義為U_Y和U_XOS組的樣本。 

試驗結果

（1）測序數據

 如圖1所示，在N_FAE和U_FAE組中分別發(fā)現了359個(gè)和329個(gè)OTU，而在U_Y和U_XOS組中分別發(fā)現了320和313個(gè)OUT；在所有四個(gè)組中共檢測到235個(gè)核心OUT；另外，N_FAE組有最多的獨特物種（52種），U_FAE、U_Y和U_XOS組中分別有7、4和4個(gè)獨特物種；UC患者和健康志愿者的腸道微生物群中大多數物種可以通過(guò)靜態(tài)發(fā)酵進(jìn)行培養，這意味著(zhù)這種腸道微生物群的體外模擬系統是可行的。

（2）α-多樣性分析

 物種豐富度和多樣性可以通過(guò)測量α-多樣性來(lái)評估，通常使用四種指數來(lái)評估：ACE和Sobs代表物種豐富度指數，而Shannon和Simpson代表物種多樣性指數。如圖2所示，緩解期UC患者的四個(gè)指數都低于健康志愿者，但這些差異并不顯著(zhù)；此外，α-多樣性在發(fā)酵后有所下降，尤其是在U_XOS組（盡管同樣并不顯著(zhù)，P>0.05）；這一結果表明，發(fā)酵可能會(huì )抑制某些細菌的生長(cháng)，而有些細菌則表現出過(guò)度生長(cháng)，尤其是在XOS的作用下?？偟膩?lái)說(shuō)，XOS發(fā)酵不能改善UC患者腸道微生物群的α-多樣性降低。

（3）β-多樣性分析

 β-多樣性分析是通過(guò)計算Bray-Curtis距離矩陣來(lái)揭示四組之間的差異，其顯著(zhù)性由ANOSIM來(lái)檢驗。如圖3所示，根據PCA，四個(gè)組顯示出明顯的分離，ANOSIM確定的P值為0.001，這意味著(zhù)四個(gè)組之間的差異具有統計學(xué)意義；更重要的是在PCoA中也觀(guān)察到類(lèi)似的趨勢；對所有樣品的分析表明發(fā)酵對微生物群的組成有重大影響，因為兩個(gè)FAE組和兩個(gè)發(fā)酵組表現出明顯的分離。

（4）群落柱狀圖分析

 如圖4所示，在門(mén)水平上，N_FAE樣品比U_FAE組含有更多的放線(xiàn)菌門(mén)和更少的變形菌門(mén)。此外，U_XOS組比U_Y組檢測到更多的放線(xiàn)菌門(mén)和更少的梭桿菌門(mén)；在科水平上，U_FAE組的擬桿菌科和雙歧桿菌科的相對豐度比N_FAE組高，而腸桿菌科的相對豐度則低。此外，U_XOS組與U_Y組的不同之處在于雙歧桿菌科和Selenomonadaceae的豐度增加，而毛螺菌科和梭桿菌科的豐度減少。

（5）識別不同豐度的分類(lèi)群

 如圖5A所示，G_Roseburia、G_Fusicatenibacter、G_Lachnospiraceae_ND3007_group、G_Butyricimonas、G_Eubacterium_halli_group、G_Oscillibacter、g_Lachnospiraceae_UCG-010、g_Bilophila、g_Turicibacter和g_Lachnospiraceae_FCS020_group的相對豐度在N_FAE組較高，而o_Lactobacillales在U_FAE組較高。如圖6A和6C所示， G_Eubacterium_halli_group、g_Lachnospiraceae_ND3007_group、g_Bilophila、g_Turicibacter和g_Butyricimonas的豐度在N_FAE組較高（P < 0.05），而g_Bifidobacterium、g_Lactobacillus和g_Lactococcus的豐度在U_FAE組較高，但差異不明顯。如圖5B所示，U_Y組中g(shù)_Lachnoclostridium、g_norank_f_Lachnospiraceae和g_Flavonifractor的豐度比U_XOS組高。如圖6B和6D所示， U_XOS組中g(shù)_Roseburia、g_Fusicatenibacter、g_Bifidobacterium和g_Lactobacillus的含量更豐富，而g_Oscillibacter、g_Bilophila和g_Lachnospiraceae_UCG-010的含量較低，但差異不大。此外，在U_XOS組和U_Y組中沒(méi)有檢測到g_Turicibacter，這意味著(zhù)它不能在發(fā)酵環(huán)境中被培養。

（6）四組中每個(gè)樣品的頂級物種鑒定和系統發(fā)育樹(shù)

 如圖7A所示，構建了一個(gè)層次聚類(lèi)樹(shù)來(lái)說(shuō)明微生物群的組成，并顯示每個(gè)樣品的聚類(lèi)關(guān)系，發(fā)現N_FAE、U_FAE、U_Y和U_XOS組的樣本分離得很好；如圖7B所示，屬水平的群落熱圖分析顯示了四個(gè)組的前20個(gè)類(lèi)群和差異豐度類(lèi)群，如g_Roseburia和g_Bifidobacterium。此外，通過(guò)群落熱圖畫(huà)出系統發(fā)育樹(shù)來(lái)說(shuō)明前20個(gè)物種的進(jìn)化關(guān)系。

試驗結論

 本研究招募了5名臨床緩解期的UC患者和5名健康志愿者，對比兩者腸道微生物群的差異，結果發(fā)現，在主坐標分析（PCoA）和主成分分析（PCA）中，UC患者的糞便樣本與健康志愿者的糞便樣本有差異；健康志愿者的g_Roseburia和g_Lachnospiraceae_ND3007_組的相對豐度高于UC患者，而o_Lactobacillales的豐度呈現相反趨勢（P<0.05）；健康志愿者中g(shù)_Eubacterium_halli_group和g_Lachnospiraceae_ND3007_group的豐度高于UC患者（P<0.05）。此外，在UC患者中， XOS發(fā)酵促進(jìn)了包括g_Roseburia、g_Bifidobacterium和g_Lactobacillus在內的細菌組的生長(cháng)，這對腸道疾病的恢復有益。以上結果表明，XOS可以緩解臨床緩解期UC患者糞便中的菌群失調，因此是一種潛在的維持緩解期的益生元。

參考資料：

Zongwei Li, Zhengpeng Li, Liying Zhu, et al. Effects of Xylo-Oligosaccharide on the Gut Microbiota of Patients With Ulcerative Colitis in Clinical Remission[J]. Frontiers in Nutrition, 2021, 8: 778542.