試驗設計 分別稱(chēng)取適量低聚木糖與乳清分離蛋白（WPI）分散在去離子水中制備固形物濃度為10%（W/V）的溶液，改變低聚木糖與WPI質(zhì)量比分別為1:1、1:2、1:3、1:4，在4℃冰箱中充分水合12 h得到溶液。反應前用0.1 mol/LNaOH調節溶液的pH為8.0，90℃水浴加熱，不同時(shí)間分別取樣后迅速冰浴終止反應，所得溶液經(jīng)冷凍干燥留待后用。取反應過(guò)程中 0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min樣品通過(guò)冰浴終止反應后測定體系的 pH 值變化；在294 nm處測定WPI和低聚木糖的美拉德反應產(chǎn)物（MRPs）的吸光度，作為非酶促褐變中間產(chǎn)物形成的指標；在420 nm處測定MRPs的吸光度，作為在更高級階段形成棕色聚合物的指標；采用比濁法計算MRPs乳化活性指數（EAI）和乳液穩定性指數（ESI）；采用DHR-2流變儀對MRPs的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定。 試驗結果 （1）反應中溶液pH變化 如圖1所示，隨著(zhù)反應時(shí)間的延長(cháng)，4個(gè)體系的pH均呈現下降趨勢。在反應最初的 0.5 h內體系pH迅速下降，此后pH緩慢下降直至反應結束，并且pH從8.01降至7.77~7.51，其中低聚木糖與WPI比例為1:4時(shí)，pH變化最小，比例為1:1時(shí)變化最大。
（2）UV-Vis吸光度的變化 如圖2a、2b所示，分別為不同比例的反應體系（低聚木糖：WPI）初始時(shí)刻和反應2.5 h時(shí)在294 nm和420 nm處的吸光度，四種體系反應后在兩種吸光波長(cháng)處的吸光度都有所增加。從294 nm處吸光度的增加來(lái)看，比例為1:2的反應體系增量最大（0.075±0.025）；而比例為1:1的反應體系增量最?。?.030±0.0073），這說(shuō)明比例為1:2 的體系在反應中產(chǎn)生的酮類(lèi)和醛類(lèi)等高活性中間產(chǎn)物最多，而比例為1:1的體系產(chǎn)生的中間產(chǎn)物最少；從420 nm處吸光度的增加來(lái)看，比例為1:2的反應體系增量最大（0.076±0.0082），說(shuō)明該比例下反應產(chǎn)生的類(lèi)黑素最多，而另外三個(gè)比例吸光度的增量無(wú)顯著(zhù)性差異，這與294 nm處結果相對應。類(lèi)黑素是由上述產(chǎn)物經(jīng)過(guò)環(huán)化、異構化、縮合等反應形成的棕色含氮聚合體，因此類(lèi)黑素的含量與中間產(chǎn)物的積累量有關(guān)，這與本文研究結果一致。
（3）低聚木糖-WPI美拉德產(chǎn)物粒徑分析 如圖3所示，WPI經(jīng)過(guò)濕熱法美拉德反應前，各體系的平均粒徑范圍均在200~450 nm；反應2.5 h后，分子量增大，而平均粒徑減小，各體系的平均粒徑范圍均在80~250 nm，其中比例為1:3的平均粒徑最小為94.88±1.88 nm，比例為1:2的平均粒徑最大為 214.83±4.80 nm。
（4）低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物的乳化性能 如圖 4a、4b所示，分別為不同比例的低聚木糖-WPI體系美拉德反應前后乳化特性的變化，其中濕熱處理前后的WPI 作為對照組。 由圖4a可知，反應前各體系乳化活性（平均為35.65±1.45 m2/g）差異性不顯著(zhù)，而相較初始體系，經(jīng)美拉德反應2.5 h的體系乳化活性稍有提高，其中比例為1:3的體系乳化活性最好（乳化活性指數為40.18±1.12 m2/g），比例為1:1的體系乳化活性最差（乳化活性指數為35.80±0.15 m2/g），但與之相反的是，WPI 經(jīng)熱處理后乳化性反而降低（34.10±0.75m 2 /g）。 由圖4b可知，反應前各體系的乳化穩定性范圍為60.06±0.88~42.30±5.88 m2/g，其中低聚木糖-WPI比例為1:1時(shí)乳化穩定性最大，比例為1:3時(shí)最小，這可能是多糖含量不同造成的差異；而美拉德反應后各體系乳化穩定性均增加，比例為1:2的乳化穩定性最好（65.23%），比例為1:3時(shí)最差（56.85%），同時(shí)熱處理后的WPI乳化穩定性也降低（41.64%±0.77%）。
（5）低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物的流變學(xué)性質(zhì) 如圖5所示，WPI及4種比例低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物的儲能模量G'和損耗模量G''隨溫度和時(shí)間的變化曲線(xiàn)。 由圖5a可知，當升溫溫度在25.80~55.29℃時(shí)，WPI溶液G''>G'，表現為流體特征，即溶膠狀態(tài)；當溫度在55.78℃時(shí)，WPI溶液開(kāi)始出現G'>G''，在88.64℃時(shí)G'的急劇增大，說(shuō)明在這個(gè)階段發(fā)生了溶液-凝膠的轉變，同時(shí)在初始的溫度上升階段（溫度范圍約為25~88.64℃），G'和 G''的值都非常?。?lt;1 Pa）。隨后G'始終大于 G''，在90℃下保持30 min期間，可能是熱誘導更多的蛋白質(zhì)分子聚集，WPI凝膠網(wǎng)絡(luò )增強，從而提高了升溫初始形成的弱凝膠彈性。隨著(zhù)溫度從90℃降至25℃，G'進(jìn)一步增大，最終達到13000 Pa以上，這種現象表明膠體網(wǎng)絡(luò )強度在冷卻過(guò)程中逐漸增強，這可能是由于變性蛋白質(zhì)之間形成了額外的非共價(jià)相互作用（如凝膠結構中的分子間氫鍵、范德華力）；在接下來(lái)的25℃平衡期間，G'和 G''幾乎沒(méi)有進(jìn)一步的改變，保持相對平行，說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)形成穩定的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò )結構。 不同比例的低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物溶液體系的模量隨溫度和時(shí)間的變化與 WPI的凝膠形成過(guò)程有所不同。在升溫階段中（25~90℃），G'和G''的變化較小，并且該值均小于10 Pa。在90℃下加熱后才觀(guān)察到MRPs溶液G'和G''顯著(zhù)增加，相比WPI曲線(xiàn)（125 s、88.64℃時(shí)開(kāi)始急劇增大）MRPs溶液G'和G''顯著(zhù)增加的時(shí)間和溫度均出現延遲（比例為 1:1、1:2、1:3、1:4 的體系分別在 147 s、154 s、167 s、129s），這種現象可能與低聚木糖的附著(zhù)導致蛋白質(zhì)變性溫度升高有關(guān)。另一方面，G'和 G''在冷卻過(guò)程中繼續增加，在接下來(lái)的 25℃平衡期間G'和 G''值逐漸變得穩定，其中比例為1:3的體系G'值高達約 97000Pa（約WPI的7倍），其次是1:2的G'值約為38000 Pa，1:4和1:1的G'值分別為 18000 Pa和13000 Pa。同時(shí)整個(gè)升溫和降溫過(guò)程，G'始終大于G''，表明低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物體系可能在25℃之前就表現出類(lèi)固體性質(zhì)。 如圖6所示，分別為WPI和4種比例低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物溶液的流動(dòng)行為，數據顯示了溶液的表觀(guān)粘度隨剪切速率的變化情況。在0.1~100 s-1的剪切速率范圍內，剪切速率不斷升高，5種體系表觀(guān)粘度不斷降低，表現出剪切稀化行為，呈現出一種典型的假塑性流體流變特性。此外，在相同剪切速率下，WPI的表觀(guān)粘度最??；雖然美拉德反應使得體系表觀(guān)粘度增加，但體系中WPI所占比例越大，其假塑性特征越明顯；隨著(zhù)WPI占比的降低，剪切速率不斷增大，表觀(guān)粘度下降逐漸減小。
試驗結論 低聚木糖-WPI質(zhì)量比為1:2時(shí)，體系美拉德反應程度最高，平均粒徑最大，乳化活性和乳化穩定性也得到最大程度的提高。此外，本實(shí)驗研究了糖基化修飾對WPI凝膠行為的影響，發(fā)現美拉德反應導致了各體系模量不同程度的增加，其中比例為1:3的低聚木糖-WPI美拉德反應產(chǎn)物的粘彈性最強，G'值約為原始WPI的7倍，結果證明美拉德反應可改善WPI的乳化特性和凝膠特性。
參考資料： 廖陽(yáng), 胡居吾, 馬永花, 熊華, 趙強. 濕熱條件下低聚木糖-乳清分離蛋白的美拉德反應及產(chǎn)物乳化性與流變性研究[J].現代食品科技,2019,35（12）:20-27+111. |
